בהיותה הגוף הראשון בישראל שפעל למען רווחת בעלי החיים וזכויותיהם, במשך שנים ארוכות היוותה האגודה שופר יחידי לבעלי החיים שאינם יכולים להשמיע את קולם, ומילאה תפקיד מרכזי בשינוי תפישות הציבור בכל הנוגע לטיפול בבעלי חיים נטושים, אימוץ חיות מחמד וניתוחי עיקור וסירוס
סיפורה של אגודת צער בעלי חיים בישראל מתחיל בשנת 1926, כאשר תיירת מאנגליה שביקרה בפלשתינה, נחשפה לחמורים הסובלים מפצעי אוכף ולסוסים פצועים וצולעים הרתומים לעגלות. רחמיה של התיירת נכמרו על בעלי החיים האומללים, ובעקבות פנייתה לשלטונות הבריטיים בשנת 1927 נפתח בית המחסה הראשון של האגודה ברחוב שלמה 30 בתל אביב. שטחו של המקלט היה פחות מדונם וניתן היה להכיל בו כ-80 בעלי חיים. לחמורים ולסוסים יוחדה אורווה רחבה, והכלבים והחתולים שהו בכלובים עם שטח מיוחד לשינה ומרחב לתנועה. במשך השנים, עם גידול הדרישה לשירותי האגודה, התווספו למבנה המקורי מבנים נוספים.
באותם ימים, ימי המנדט הבריטי, הורכבה כמעט כל אוכלוסיית בעלי החיים שטופלה בבית המחסה מגמלים, סוסים וחמורים, ששימשו כאמצעי תחבורה לאנשים, לסחורות ולחומרי גלם. בחוליים ובזקנתם חדלו בעלי חיים אלה לפרנס את בעליהם, והם הוזנחו באכזריות וננטשו.
בימיה הראשונים של המדינה, בעלי חיים כמו כלבים וחתולים נתפשו בקרב הציבור המקומי כאיום פיזי ובריאותי, בעיקר בשל החשש מכלבת. אנשים רבים נמנעו ממגע איתם ואחרים התייחסו אליהם באכזריות שמקורה בפחד.
הפעילויות היומיומיות של המקלט התמקדו בשלושה תחומים: טיפול בבעלי חיים נטושים ובלתי רצויים, הפעלת מרפאה וטרינרית במחירים שווים לכל נפש וניהול פנסיון לחיות מחמד שהכיל מקום ל-20 בעלי חיים.
במהלך השנים השתנה הרכבם של בעלי החיים המטופלים בבית המחסה בהתאם לשינויים שהתרחשו באקלים החברתי והכלכלי בארץ: החל מ-1950 קטן השימוש בבהמות המשא, שהוחלפו ברכב ממונע. המנהג של גידול חיות מחמד הלך והתרחב, אך המחויבות לטפל בהן במהלך כל שנות חייהן עדיין לא הושרשה בתרבות המקומית. רבים מהבעלים עייפו מאחריותם ונטשו את חיות הבית שלהם או את גוריהן, ואלה נידונו לתת-תזונה, רעב, מחלות ואף אכזריות מצד עוברי אורח.
חייהם של בעלי החיים הנטושים היו קצרים וקשים, ברחוב או במעבדות ניסוי. מאז ייסודה הפעילה האגודה רכב חילוץ להצלתם של אותם בעלי חיים אומללים. הרכב סרק את הרחובות, נענה לקריאות וחילץ בעלי חיים פצועים וחולים: חתולים מפוחדים שנתקעו על עצים, עמודים או גגות, כלבים שנפלו לבורות או בארות, סוסים וחמורים שנפגעו בתאונות ועוד. האגודה אף הפעילה לחצים לקבל לחזקתה בעלי חיים נטושים שנאספו על ידי הרשויות המקומיות במטרה להעבירם למוסדות מחקר אוניברסיטאיים ולבתי חולים.
החל מיומה הראשון מחזיקה האגודה במדיניות ברורה, לפיה אין לדחות אף בעל חיים הנתון במצוקה. יש לעשות כל מאמץ למצוא בית חם לכל בעל חיים, אך מחמת חולי, גיל או בעיות התנהגותיות, חלק מבעלי החיים אינם מתאימים לאימוץ והפתרון עבורם הוא המתת חסד. כמו כן, מאז שנות ה-60 של המאה הקודמת דוגלת האגודה בעיקור ובסירוס של כל בעלי החיים הנמסרים לאימוץ, במטרה לצמצם ככל האפשר את בעיית ההתרבות הבלתי מבוקרת של בעלי חיים בלתי רצויים.